Sichtbar durch Färben

Färbungen helfen bei der Interpretation von Blutausstrichen.
Um die Vergleichbarkeit sicherzustellen, müssen sie aber nach standardisierten Protokollen erfolgen.

Text Dr. med. Thomas Binder

Zytologische Präparate werden üblicherweise gefärbt untersucht, aber auch ungefärbte Präparate können wertvolle Informationen liefern. Mittlerweile gibt es für die hämatologische Zytologie und die Organzytologie eine weltweit gültige Standardfärbung. Schnellfärbungen bringen hingegen schwerwiegende Qualitätseinbußen mit sich. Bei spezifischen Fragestellungen werden zahlreiche zum Beispiel zytochemische Spezialfärbungen zusätzlich angefertigt; sie werden aber zunehmend von der Analyse mit monoklonalen Antikörpern abgelöst. Die Mikroskopie ist die Referenzmethode für die Beurteilung von Zellen; es ist nicht abzusehen, ob und wann neue Verfahren sie ersetzen. Technische Verfahren werden aber schon heute für zuverlässige quantitative Aussagen zusätzlich verwendet (etwa die Zählung und Klassifikation von Retikulozyten). Morphologische Untersuchungen durch Bilderkennung (zum Beispiel CellaVision®) sind mittlerweile sehr leistungsfähig und werden für Routine-Untersuchungen eingesetzt. Bei verdächtigen oder pathologischen Befunden wird die Untersuchung durch Nachklassifikation der vom Computer erfassten Bilder oder durch konventionelle Mikroskopie des Ausstrichs ergänzt oder korrigiert.

Dr. med. Thomas Binder

Dr. med. Thomas Binder war als Mitglied im Arbeitskreis Laboratorium der DGHO maßgeblich an der Konzeption des Protokolls zur standardisierten Pappenheim-Färbung beteiligt

Eine kurze Geschichte der Färbung

Die Pappenheim-Färbung (May-Grünwald-Giemsa, MGG) und die Wright-Giemsa-Färbung sind panoptische Färbungen aus der Gruppe der sogenannten Romanowsky-Giemsa-Färbungen, sie stellen die Zytoplasmata, Granula und Zellkerne detailliert und unterschiedlich gefärbt dar (Polychromie).

So haben sich die Färbeverfahren entwickelt:

  • 1877 Paul Ehrlich unterteilt die Anilinfarbstoffe in basische und saure Farbstoffe und wendet sie als Erster auf die Färbung von Blutbildern an. Die modernen Blutfärbungen gehen auf ihn zurück
  • 1880 Charles Louis Alphonse Laveran entdeckt den Malariaparasiten
  • 1888 Cheslav Ivanovich Chenzinsky publiziert als Erster eine Malaria-Färbung
  • 1890 Friedrich Plehn, 1891 Ernst Malachowky und 1891 Dmitri Leonidovich Romanowsky beschreiben unabhängig voneinander Verbesserungen der Färbung mit Methylenblau und Eosin
  • 1898 Bernhard Nocht und 1902 Gustav Giemsa entwickeln die jetzt nach Romanowsky benannte Färbung weiter, ebenfalls zum Nachweis von Malariaparasiten
  • 1912 Arthur Pappenheim veröffentlicht eine „panoptische Universalfärbung für Bluttrockenpräparate“, in der die Färbungen von Louis Jenner (1899) beziehungsweise von Richard May und Ludwig Grünwald (1902) jeweils mit der Giemsa-Färbung kombiniert werden. Diese Vorschrift ist seitdem als Pappenheim-Färbung beziehungsweise May-Grünwald-Giemsa-Färbung im deutschen Sprachraum zu einem Standard geworden.
  • 1981 Die Arbeitsgruppe von Paul N. Marshall – ab 1983 auch die von Dietrich H. Wittekind – beschäftigt sich ausführlich mit den Grundlagen der Romanowsky-Giemsa-Färbungen
  • 1984 Das International Council for Standardization in Hematology (ICSH) übernimmt das Protokoll von Wittekind als Standardmethode. Diese Färbung mit den gereinigten Farbstoffen AzurB und EosinY, ohne Methylenblau, ergibt eine mit der Pappenheim-Färbung verwandte Anfärbung;
    sie hat sich aber nicht überall durchgesetzt, ebenso wenig wie die ähnlichen, von Marshall publizierten Färbungen mit reinem AzurB und EosinY (± Methylenblau)

 

 

Korrekte Pappenheim-Färbung des Ausstrichs von Blut im Fall einer T-LGL-Leukämie

 

„Bilder sind Meinung, nur Zahlen sind Fakten? Dieses Vorurteil gilt es zu widerlegen.“
Dr. med. Thomas Binder

 

Nachdem Wittekind und seine Mitarbeiter das physikalisch-chemische Prinzip dieser Romanowsky-Typ-Färbungen aufgeklärt haben, wundert es nicht, dass verschiedene ähnliche Protokolle weitgehend gleich aussehende Bilder ergeben. 2008 hat dasICSH eine Richtlinie für die Knochenmarkdiagnostik publiziert und dort eine Romanowsky-Färbung vorgeschrieben (MGG- oder Wright-Giemsa-Färbung). Damit können diese Färbungen offiziell als gleichwertig betrachtet werden. 

Die Nomenklatur der Wright-Färbung ist problematisch; der reinen Wright-Färbung fehlt der Giemsa-Anteil und damit der hohe AzurB-Anteil, der durch Ausbildung eines Komplexes mit EosinY zur Bildung einer neuen Farbe vor allem in den Kernen führt (Romanowsky-Effekt).

Einheitlichkeit durch DGHO -Protokoll

Das Standardprotokoll der Deutschen Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie (DGHO) wurde 2012 publiziert. Diese Pappenheim-Färbung entspricht dem schon seit etwa 1990 von vielen deutschen hämatologischen Einheiten und dem für die deutschen Ringversuche verwandten Verfahren. Eigene Untersuchungen ergaben, dass nach diesem Protokoll gefärbte Präparate beispielsweise australischen Ringversuchspräparaten, Präparaten der ICSH-Färbung von 1984 und aktuell publizierten Bildern (Atlanten, im Internet publizierte Bilder) weitgehend entsprechen. Überdies entsprechen sie den schriftlichen Beschreibungen von Pappenheim. Das DGHO-Protokoll beschreibt nicht nur die eigentliche Färbung, sondern ausführlich alle Maßnahmen, die Einfluss auf das Endergebnis nehmen. Darüber hinaus werden die lokale Qualitätskontrolle und vor allem auch häufig gefundene Fehler beschrieben. Die Richtigkeit der Färbung kann durch Kolorimetrie an gefärbten Objektträgern gemessen werden.

Abweichende Ergebnisse sind zumeist Folge von Fehlern außerhalb der eigentlichen Färbung: Schwerwiegende Abweichungen verursachen vor allem zu alte, unzureichend getrocknete Präparate, mangelhafte Fixierung, Verwendung ungepufferten Wassers anstelle von Pufferlösung und Verwendung alter verbrauchter Farblösungen.

Mit den Standard-Färbungen (Pappenheim, Wright-Giemsa) können alle zytologischen Präparate (Blut, Liquor, Ergusszytologie, Organzytologie, Knochenmarkzytologie …) gefärbt werden; bei „dicken“ Präparaten wie bei der Knochenmarkzytologie ist besonders auf eine gründliche Fixation mit unverbrauchtem Methanol zu achten. Mit Färbeautomaten gefärbte Präparate können identisch oder zumindest weitgehend gleich aussehen wie die in Küvetten (Referenzmethode) gefärbten Präparate.

Ist Färben also Glaubenssache? Nein

Natürlich vertraut jeder erfahrene Mikroskopiker seiner persönlichen Färbemethode. Nachdem aber nicht nur diese „interne“ Qualitätskontrolle, sondern auch eine „externe“ unerlässlich ist, muss sich jeder an einen akzeptierten Standard halten. Zur Qualitätskontrolle in Deutschland versandte Ringversuchspräparate werden nach dem DGHO-Standardprotokoll gefärbt. Sie sind nur dann uneingeschränkt befundbar – und dienen als Bildbeispiele für eine korrekte Färbung –, wenn sich jeder an das Aussehen dieser Präparate angepasst hat.

Nachdem heutzutage zuverlässige Farblösungen erhältlich sind, kann man überall identische Färbungen ausführen. Es ist einfach, von einer „persönlichen Variante“ auf ein Standardprotokoll umzustellen, wie die Erfahrungen mit vielen Laboratorien belegen. Eine gute Färbung zeigt alle zytologischen Details kräftig angefärbt, mit maximaler Buntheit, ohne dabei andere Details zu überdecken. 

Beispiele

  • Die toxische Granulation wird bei unterschiedlich intensiven Färbungen sehr unterschiedlich bewertet, weil für diese Aussage zuerst die Sichtbarkeit und Zahl der Granula und erst dann die Größe der Granula bewertet wird 
  • Ähnliches gilt auch für die Frage nach hypogranulären Granulozyten: Nur bei intensiver Anfärbung kann man eine Verminderung oder das Fehlen vonGranula bewerten. Das Chromatin ist fein strukturiert abgebildet und erlaubt dadurch die Unterscheidung sehr ähnlicher Zellen

 

Färbung ist also nicht Glaubens- oder Geschmackssache, sie hat einem definierten Standard zu folgen.

Objektivität am Mikroskop

Die mikroskopische Untersuchung ist eine subjektive, bildlich-künstlerische Tätigkeit. Erst durch eine klare Nomenklatur der Zellen und der mikroskopischen Phänomene sowie klare Befundungsregeln kommt man zu möglichst objektiven Ergebnissen.

Der Befundungsvorgang am Mikroskop ist komplex; man kann ein Präparat nicht „mal einfach schnell“ ansehen, sondern braucht Geduld und Wachheit. Man braucht eine gute Ausbildung und große Erfahrung und einen stetigen Abgleich mit dem Wissen der anderen.

Der Mikroskopiker muss unvoreingenommen sein, also das Präparat möglichst ohne Kenntnis der quantitativen Werte und der Fragestellung beziehungsweise der klinischen Informationen ansehen. Sonst sieht er eventuell nur das, was er erwartet, und unterschlägt das Unerwartete.

Wenn man in einem Differenzialblutbild die erforderliche Zahl der Zellen klassifiziert hat (Leukozyten, Erythrozyten, Thrombozyten), fasst man das Ergebnis zu einem Befund zusammen und sucht dann danach, was zum Befund passt und was nicht. Bei diesem Vorgang entdeckt man häufig Dinge, die man nicht erwartet hat (nur so findet man beispielsweise einen vereinzelten Blasten). Erst anschließend verknüpft man die Mikroskopie mit den Vorinformationen (Zahlen, klinische Daten, Fragestellung) und muss dann eventuell nochmals ins Mikroskop sehen und bestimmte Dinge suchen oder ausschließen.

Dies klingt aufwendig, wird aber von allen erfahrenen Untersuchern so durchgeführt. Nur bei einem solchen Vorgehen erreicht man eine ausreichende Objektivität. „Bilder sind Meinung, nur Zahlen sind Fakten“ – dieses Vorurteil gilt es zu widerlegen.

Literatur beim Verfasser: thomas.rh.binder@googlemail.com

Schwerpunktthema "Ist Färben Glaubenssache"

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